Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
В настоящем разделе описаны шесть методов:
Метод А. Гель-тромб-метод: предельное испытание.
Метод В. Гель-тромб-метод: полуколичественное испытание.
Метод С. Турбидиметрический кинетический метод.
Метод D. Хромогенный кинетический метод.
Метод Е. Хромогенный метод конечной точки.
Метод F. Турбидиметрический метод конечной точки.
Испытание выполняют любым из этих шести методов. В сомнительных и спорных случаях окончательное решение принимают, основываясь на методе А, если иное не предписано в частной статье.
Испытание выполняют в условиях, не допускающих загрязнения посторонними эндотоксинами.
Оборудование
Всю стеклянную посуду и другую термоустойчивую аппаратуру депирогени-зируют в сухожаровом шкафу с использованием процесса с подтвержденной эффективностью. Общеприняты минимальные значения времени и температуры обработки, составляющие 30 минут и 2500С, соответственно. При использовании пластиковой аппаратуры, например, микротитрационных планшетов и наконечников для автоматических пипеток, следует продемонстрировать отсутствие на ней поддающихся определению эндотоксинов и мешающих факторов.
Примечание: в данном разделе термин «пробирка» включает в себя все типы сосудов, например, микротитрационные планшеты.
Приготовление исходного стандартного раствора эндотоксина
Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят из стандартного образца эндотоксина, калиброванного по отношению к международному стандарту, например из Стандартного образца эндотоксина BRP.
Количественное содержание эндотоксина выражают в Международных Единицах (МЕ). Эквивалентность международного стандарта в международных единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Примечание: Одна международная единица (МЕ) эндотоксина эквивалентна одной единице эндотоксина (ЕЭ).
Исходный стандартный раствор эндотоксина готовят и хранят, следуя спецификациям, приведенным на листке-вкладыше и этикетке.
Приготовление стандартных растворов эндотоксина
Необходимые последовательные разведения предварительно интенсивно перемешанного исходного стандартного раствора эндотоксина готовят с использованием воды для испытания на бактериальные эндотоксины (вода для ИБЭ). Эти растворы используют по возможности быстро, чтобы избежать потери активности вследствие адсорбции.
Приготовление испытуемых растворов
Испытуемые растворы готовят путем растворения или разбавления активных субстанций или медицинской продукции с использованием воды для ИБЭ. Для некоторых субстанций и препаратов более подходящим является растворение или разбавление с использованием других водных растворов. При необходимости, доводят значение рН испытуемого раствора (или его разведения) так, чтобы рН его смеси с лизатом находилось в интервале, предписанном производителем лизата. Обычно это относится к продукции со значением рН в интервале от 6,0 до 8,0. Значение рН может быть доведено с использованием кислоты, основания или подходящего буферного раствора, по рекомендациям производителя лизата. Кислоты и основания могут быть приготовлены из концентратов или порошков с использованием воды для ИБЭ в контейнерах, не содержащих определяемых количеств эндотоксина. Должно быть подтверждено отсутствие в буферных растворах отсутствие эндотоксинов и мешающих факторов.
Определение максимально допустимого разведения
Максимально допустимое разведение (МДР) - максимальное разведение образца, при котором может быть определено предельное содержание эндотоксина. МДР вычисляют по формуле:
М 4ПР Предельное содержание эндотоксинов х Концентрация испытуемого раствора
Д ~ Я ’
Предельное содержание эндотоксинов: для активных субстанций, предназначенных для парентерального введения, равно:
K
M ’
где
К - допустимая пирогенная доза эндотоксина, вводимая в течение часа на
килограмм массы тела,
М - максимальная рекомендованная доза продукта, вводимая в течение ча-
са на килограмм массы тела.
Предел эндотоксина для активных субстанций, предназначенных для парентерального введения, указывается в частных статьях и выражается в таких единицах, как МЕ/мл, МЕ/мг, МЕ/(единица биологической активности) и т.д.
Концентрация испытуемого раствора:
- в мг/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в массовых единицах (МЕ/мг),
- в Ед/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в пересчете на единицу биологической активности (МЕ/Ед)
- в мл/мл, если предельное содержание эндотоксинов выражено в объемных единицах (МЕ/мл).
Л - чувствительность лизата в гель-тромб-методе, указанная на этикетке, или низшая точка стандартной кривой в турбидиметрических или хромогенных методах.
ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ТРОМБА (МЕТОДЫ А И В)
Гель-тромб-методы позволяют определять наличие и количество эндотоксинов и основываются на эффекте свертывания лизата в присутствии эндотоксинов. Концентрация эндотоксинов, требующаяся для свертывания лизата в стандартных условиях, представляет собой указанную на этикетке чувствительность лизата. Для обеспечения точности и достоверности испытания указанную чувствительность лизата следует подтвердить, а также провести испытание на мешающие факторы, описанное в подразделе «1. Предварительные испытания».
